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Calcein-AM是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，Calcein-AM由于在Calcein的基础上加强了疏水性，因此能够轻易穿透活细胞膜。当其进入到细胞质后，酯酶会将其水解为Calcein留在细胞内，发出强绿色荧光。与其它同类试剂(如BCECF-AM和Carboxy-fluorescein diacetate)相比，Calcein-AM是最适合作为荧光探针去染活细胞的，因为它的细胞毒性很低。Calcein的激发和发射波长分别为490nm和515nm。

Calcein,AM仅对活细胞染色。作为核染色染料的PI不能穿过活细胞的细胞膜，它穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的DNA双螺旋从而产生红色荧光(激发：488,545nm，发射：617nm)，因此PI仅对死细胞染色。

由于Calcein和PI-DNA都可被490nm激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。用545nm激发，仅可观察到死细胞。根据以上特点，Calcein,AM和PI经常被结合用来作为活细胞和死细胞的双重染色。

本染色方法适用于荧光显微镜、荧光酶标仪等微孔板荧光扫描设备、流式细胞仪或其他的荧光设备。本染色方法适用于大多数真核细胞，包括贴壁细胞和某些组织样本，但不包括细菌和酵母样本。

需要注意的是Calcein,AM/PI双染有效染色的前提是相应的细胞模型的活力变化是指酶活性变化和质膜完整性变化这些物理和生化特性，不影响这些细胞特性的细胞毒性事件可能不能使用此方法进行准确评估。

组分	500T	1000T
试剂A:染色液Calcein AM	100μL	100μL×2
试剂B:染色液PI	200μL	200μL×2
试剂C:染料稀释液	10mL	20mL

保存：试剂A置于-20℃避光，试剂B、C置于2～8℃，有效期1年

• 试剂A短期可2～8℃保存，长期不用可以-20℃保存，避免反复冻融。
  
• 染色液Calcein AM注意防潮，避免反复冻融。
  
• 染色液A为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否则容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。融解后离心至管底部再打开螺旋盖。
  
• 注意需要加热融解，变成液体状态后离心至管底部再开盖。可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。
  
• 试剂B溶解后需要用吸头吹打混匀。

荧光显微镜/激光共聚焦/流式细胞仪、PBS或HBSS、移液器、离心机

• 本试剂盒仅供科学研究使用，不可用于诊断或治疗。
  
• 螺旋盖微量管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。
  
• 染色液A为DMSO溶液，冬季气温低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否则容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。溶解后离心至管底部再打开螺旋盖。
  
• 试剂A为了便于观察防止误操作导致损失，在试剂盒中时是采用透明管包装，收到后可以离心移入干燥黑色避光密封管或者用铝箔包裹避光。
  
• 细胞处理需要小心操作，尽量避免人为的损伤细胞。
  
• 由于Calcein-AM工作液稳定性较差，染色工作液必须现配现用，且当天用完。
  
• Calcein-AM对湿度非常敏感，若是Calcein-AM溶液每次取完需要量后，必须紧紧密封盖子。建议根据单次用量，分装密封保存。不可使用含水吸头。
  
• 试剂A母液请拧紧螺旋盖，避免受潮失效。
  
• 以下以培养细胞收集后染色为例。原位染色以染色液充分覆盖细胞样本即可。
  
• 有效染色的前提是相应的细胞模型的活力变化是指酶活性变化和质膜完整性变化这些物理和生化特性，不影响这些细胞特性的细胞毒性事件可能不能使用此方法进行准确评估。

关于染色条件的优化：

• 不同的细胞类型和细胞模型情况会明显影响荧光的量。
  
• 标记的条件因细胞种类而异，根据不同样本的实际染色结果做相应调整，在每次实验前，请先根据不同的实验要求、细胞类型、细胞的膜通透性等进行优化，确定最佳条件。
  
• 可以使用以下方法来优化得到两种荧光染料的最佳工作浓度。
  
  • 采用以下方法获得死细胞：用0.1%皂素或者0.1～0.5%毛地黄皂苷处理细胞10min，或者用70%乙醇孵育细胞30min，从而制备死细胞。
    
  • 用4000倍～400倍稀释(试剂盒中的母液)的PI溶液进行死细胞染色，以得到仅仅对细胞核染色，而不会对细胞质染色的最佳工作浓度。
    
  • 用1000倍～100倍稀释(试剂盒中的母液)的Calcein-AM进行活细胞染色，以得到不会对细胞质染色的最佳工作浓度。然后用此浓度进行活细胞染色，去观察是否活细胞能被染色(如果没有染色，则尝试更高的浓度)。
• 通过以上方法优化的染色浓度为最佳活死细胞染色浓度。
  
• 监控染色时间过程以确定最佳孵育时间(一般尝试每10分钟进行一次测量)。

染色工作液的配制：
根据样品数按下列比例配制染色工作液。
用染料稀释液试剂C将染色液A和B分别10倍稀释。
每10mL HBSS缓冲液或无血清培养基中加入100μL稀释过的染色液A，充分混匀，即成染色工作液A。
每10mL HBSS缓冲液或无血清培养基中加入20～200μL稀释过的染色液B，充分混匀，即成染色工作液B。

• 由于不同细胞系的最佳染色条件不同，初次实验建议做梯度试验，以确定Calcein-AM和PI的最适浓度。梯度筛选的原则为使用最低的探针浓度得到最好的荧光效果。Calcein-AM染色时间一般15～40分钟。
  
• 一般细胞Calcein-AM染色终浓度为试剂盒中母液的1000倍稀释即可，个别细胞可能需要提高浓度至500倍稀释或者延长染色时间。
  
• PI的使用终浓度为试剂盒中母液的1000～8000倍稀释，常用2000～5000倍，适合大多数细胞样本。
  
• Calcein-AM和PI溶液分开进行染色，先用Calcein-AM染色，再用PI染色。
  
• 注意PI的浓度在染上色的前提下尽可能低，否则可能有细胞毒性，使原本的活细胞上色。
  
• 可以不用本试剂盒的染料稀释液，直接用HBSS、无血清培养基配染色工作液。不可以用含血清培养基配制。
  
• Calcein-AM染色工作液必须现配现用，并且在当天用完。
  
• 样品量较少时，也可不预先配制染色工作液，直接按优化好的终浓度将染色液母液加入无血清培养基或缓冲液染色。

荧光显微镜观察：

• 准备样本细胞。
  
  • 贴壁细胞可以在无菌玻璃盖玻片上培养直至获得到可以接受的细胞密度，也可以在一次性培养皿中培养细胞，或其他合适的容器。
    
  • 也可以使用非贴壁细胞。
• 用PBS洗涤细胞2～3次。
  
  • 由于培养基中的血清等含有酯酶，导致Calcein-AM遇水会分解，导致空白上升，所以需要用PBS洗涤数次直至完全洗净。
    
  • 贴壁细胞可以原位染色，注意吸除培养基前用培养板离心机离心，防止丢掉漂浮的死细胞。PBS洗涤时也需要离心培养板。
    
  • 用500-1000体积的细胞培养级别的PBS洗涤非贴壁细胞，离心沉淀。将细胞悬液转移到盖玻片上。
• 用100～150μL染色工作液A至盖玻片将细胞样品覆盖(或重悬)。
  
  • Calcein-AM溶液和PI溶液可以分开进行染色，先用Calcein-AM染色，再用PI染色，也可以混合在一起同时染色。初次实验时，最好分开染色。经过多次实验优化后，能确定两种染料的最佳浓度后可以混合在一起同时染色。
    
  • 以上染色液用量以盖玻片为例，其他培养器皿的细胞样本请根据实际情况调整染色液用量，保证染色液充分覆盖细胞。
• 在室温或37℃避光孵育20～45分钟。
  
  • 以分开染色为例，一般染色15～45分钟。
    
  • 同时染色时，一定要注意PI浓度，防止染色活细胞。
• 用PBS洗涤细胞。
  
  • 如有必要，使用含有阴离子转运抑制剂的缓冲液来进行细胞清洗。
• 用100～150μL染色工作液B至盖玻片将细胞覆盖(或重悬)。
  
• 在室温或37℃避光孵育10～45分钟。
  
• 用PBS洗涤细胞。
  
• 用荧光显微镜检测结果。最大激发为490nm，最大发射波长分别为515nm和617nm。
  
  • 在荧光显微镜下观察时，如果背景高，可以用培养基再次清洗掉细胞外的染料后再观察。

显微镜结果分析：
荧光显微镜下，使用488nm波长激发，活细胞为黄绿色，死细胞为红色。
用545nm波长激发，仅能够看到红色的死细胞。

• Calcein和PI可以使用常规的荧光素长通滤光片。
  
• Calcein和PI也可以单独观察；Calcein可以用可以看到标准的FITC荧光素的带通滤波器观察；PI使用带有PI或TexasRed染料的过滤器观察。

流式细胞仪检测：

• 收集细胞。
  
  • 可以用胰酶-EDTA等消化细胞，制备成细胞悬液。
• 用PBS洗涤细胞两次。
  
  • 由于培养基中的血清等含有酯酶，导致Calcein-AM遇水会分解，导致空白上升，所以需要用PBS洗涤数次直至完全洗净。
    
  • 注意吸除培养基前用培养板离心机离心，防止丢掉漂浮的死细胞，PBS洗涤时也需要离心培养板。
• 制备1mL细胞悬浮液，浓度为0.1至5×10⁶细胞/mL。细胞可以在无血清培养基或其他缓冲液中重悬。
  
  • 也可以用配置好的染色工作液直接重悬细胞。
• 在细胞中加入适量Calcein-AM溶液和适量PI母液，混匀。
  
  • 此处以同时染色为例，也可分开染色。
• 在室温或37℃避光孵育15～30分钟。
  
• 尽快用流式细胞仪检测结果。
  
  • 在1小时内检测。
    
  • 使用流式细胞仪分析染色的细胞，488nm激发并测量Calcein绿色荧光发射(530nm/30带通。以实际机器配置为准)和PI红色荧光发射(即610/20带通。以实际机器配置为准)。
    
  • 流式检测时需要绿色和红色分别单色染色的细胞进行仪器补偿设置。

荧光酶标仪检测：

• 在微孔板中准备细胞样本孔以及对照孔。
  
  • 需要定量时，注意设置全活、全死细胞对照孔。
    
  • 还需要设置无细胞对照孔，以测试来自被测细胞、细胞处理药物的背景荧光或来自培养基中的其他添加剂的荧光。
• 用PBS洗涤细胞2～3次。
  
  • 由于培养基中的血清等含有酯酶，导致Calcein-AM遇水会分解，导致空白上升，所以需要用PBS洗涤数次直至完全洗净。
    
  • 贴壁细胞可以原位染色，注意吸除培养基前用培养板离心机离心，防止丢掉漂浮的死细胞。PBS洗涤时也需要离心培养板。
    
  • 洗涤相对不粘连细胞(例如白细胞/其他悬浮细胞样本)时注意避免丢失细胞。
• 加入200μL染色工作液。
  
  • 以96孔板为例，其他培养器皿以实际需要为准。
    
  • Calcein-AM溶液和PI溶液可以分开进行染色，先用Calcein-AM染色，再用PI染色。也可以同时染色。
    
  • 需要预先优化染色条件，根据不同仪器灵敏度，光学滤镜设置的变化，不同的细胞数量或类型等，需要不同的染料浓度。
• 在室温或37℃避光孵育15～45分钟.
  
  • 同时染色时，一定要注意PI浓度，防止染色活细胞。
• 用PBS洗涤细胞。
  
• 加入适量PBS。
  
• 用荧光酶标仪/荧光光度计检测结果。最大激发波为490nm，最大发射波长为525nm和617nm。
  
  • 注意选择酶标仪的滤光片，为了使用酶标仪获得最大的灵敏度，我们建议使用各种染料的最佳激发荧光团化学滤光片。Calcein使用荧光素激发滤光片(485±10nm)，而PI使用典型的Rhodamin激发滤光片(530±12.5nm)。
    
  • 荧光发射应单独获取，Calcein在530nm±12.5nm，PI在620±20nm。
    
  • 需要定量计算时注意设置各种细胞对照孔。

酶标仪结果分析：
可以根据不同荧光强度来计算样品中活细胞和死细胞相对数量(以百分比表示)，或者活细胞/死细胞的绝对数量。
% Live Cell=(F(530)sam-F(530)min)÷(F(530)max-F(530)min)×100%
% Dead Cell=(F(620)sam-F(620)min)÷(F(620)max-F(620)min)×100%

① 实验待测细胞样品。用Calcein-AM标记，用PI标记。在620nm处的荧光=F(620)sam
② 实验待测细胞样品。用Calcein-AM标记，用PI标记。在530nm处的荧光=F(530)sam
③ 所有细胞都死亡的样品。仅PI标记。在620nm处的荧光=F(620)max
④ 所有细胞都死亡的样品。仅Calcein-AM标记。在620处的荧光=F(620)min
⑤ 所有(或几乎所有)细胞存活的样品。仅PI标记。在530nm荧光=F(530)min
⑥ 所有(或几乎所有)细胞存活的样品。仅Calcein-AM标记。在530nm荧光=F(530)max
⑦ 无细胞样品。加或者不加染料。在530nm下的荧光=F(530)0
⑧ 无细胞样品。加或者不加染料。在620nm下的荧光=F(620)0

• 定量时一定需要设置相应的对照，以控制背景荧光的来源。
  
• 所有待测样品以及对照孔需要平行操作，即保持恒定的细胞数，试剂浓度，孵育时间和温度等条件。
  
• 全部细胞死亡的样品的制备方法参考染色条件优化部分。
  
• 由于样品荧光强度/总荧光强度与对应的细胞活力/数量呈线性关系，因此活细胞和死细胞的绝对数量确定，或者细胞死亡率/存活率的测量，可以通过待测样品的荧光强度与全活/全死细胞样品的总荧光强度来计算。
  
• 一般而言，细胞活力实验中，为了表达细胞活力而进行的一组活力实验的终点的活细胞和死细胞的绝对数量就是反映生存力。实际以自己的实验设计为准。

• 所有细胞都染上红色？
  PI浓度过高会导致活细胞也被染色，需要优化PI的使用浓度，稀释至仅对死细胞核染色，而不会对细胞质染色的最佳工作浓度。
  
• 细胞被同时染上绿色和红色？
  样本中有大量晚期凋亡细胞时，细胞胞浆会有Calcein着色并呈碎片状，而且PI也为阳性。

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